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激光扫描共聚焦显微镜的基本原理与应用

发表时间:2021-06-21 14:32作者:宜沃检测

激光扫描共聚焦显微镜( laser scanning confocalmicroscopy , LSCM)是近代生物医学图象仪器,它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置,使用紫外光或可见光激发荧光探针。该仪器利用计算机、激光和图像处理技术获得细胞或组织内部微细结构的荧光图象,以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。该仪器作为目前最先进的分子细胞生物学的分析仪器,主要用于观察活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化、定量分析以及实时定量测定等。


传统荧光显微镜使用荧光物质标志细胞中的特定结构,不仅图像与背景的对比度增强,而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光,大大地提高了分辨率。但当所观察的荧光标本稍厚时,传统荧光显微镜会存在一个难以克服的缺点∶焦平面以外的荧光结构模糊、发虚,如图1所示。这是由于大多数生物学标本是层次区别的重叠结构,如耳蜗基底膜,它其实是外毛细胞、多种支持细胞和神经纤维等组成的空间结构。在普通光学显微镜下聚焦平面的变化,会表现出不同的形态。假若荧光标记的结构在不同层次上都有分布,并且重叠在一起,则反射荧光显微镜不仅从焦平面上收集光量,而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜所接收,会导致荧光显微镜的光学分辨率大大降低。

激光扫描共聚焦显微镜则是在传统光学显微镜的基础上,利用激光作为光源采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。



激光扫描共聚焦显微镜的结构与原理


激光扫描共聚焦显微镜的结构

激光扫描共聚焦显微镜是在传统光学显微镜基础上发展而来的,其结构组成除了包括普通光学显微镜的基本构造外,还包括激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统(包括数据采集.处理、转换、应用软件)、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统等部分,如图4所示。


图4 激光扫描共聚焦显微镜的基本结构示意图



激光扫描共聚焦显微镜的工作原理

激光扫描共聚焦扫描显微镜是利用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,扫描的激光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦,扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时,就可以获得样品不同深度层次的图像,这些图像信息都储于计算机内,通过计算机分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构。


详细来讲,激光扫描共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式,采用激光束作光源,激光束经照明针孔,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中如果有可被激发的荧光物质,受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管探测收集,并将信号输送到计算机,处理后在计算机显示器上显示图像。这种由焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成的一幅完整的共焦图像,称为光切片。在这个光路中,只有在焦平面的光才能穿过探测针孔,焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的,不能通过小孔。因此,非观察点的背景呈黑色,反差增加,成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共辄的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,即共聚焦。以激光作光源并对样品进行扫描,在此过程中两次聚焦,因此该仪器称为激光扫描共聚焦显微镜。



4激光扫描共聚焦显微镜的优缺点

4.1激光扫描共聚焦显微镜的优点

激光扫描共聚焦显微镜是在传统荧光显微镜的基础上进行改进设计,因此具有许多优点,如下所示∶

( 1 )LSCM的图象是以电信号的形式记录下来的,所以可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图象处理;

( 2 )LSCM利用共聚焦系统有效排除了焦点以外的光信号干扰,提高了分辨率,显著改善了视野的广度和深度,使无损伤的光学切片成为可能,达到了三维空间定位;

( 3)由于LSCM能随时采集和记录检测信号,为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径;

( 4 )LSCM除具有成像功能外,还有图象处理功能和细胞生物学功能;前者包括光学切片、三维图象重建、细胞物理和生物学测定、荧光定量、定位分析以及离子的实时定量测定﹔后者包括黏附细胞的分选、激光细胞纤维外科及光陷进白后恢复技术等;

(5)可以对样品进行断层扫描和成像,进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构﹔

(6)利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针,该技术不仅可观察固定的细胞、组织切片,还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值和膜电位等生理信号及细胞形态的变化;成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具,极大地丰富了人们对细胞生命现象的认识;

(7)具有高分辨率、高灵敏度、“光学切片”、三维重建、动态分析等优点,因而为基础医学与临床医学的研究提供了有效手段;

(8) LSCM对荧光样品的观察具有明显的优势,只要能用荧光探针进行标记的样品就可用其观察。


4.2激光扫描共聚焦显微镜的缺点

( 1)标记染料的光漂白∶为了获得足够的信噪比必须提高激光的强度,而高强度的激光会使染料在连续扫描过程中迅速褪色;

(2)光毒作用:在激光照射下,许多荧光染料分子会产生单态氧或自由基等细胞毒素﹔限制扫描时间、激发光强度,以保持样品的活性。


5激光扫描共聚焦显微镜的样品要求

(1)样品经荧光探针标记;

(2)固定的或活的组织﹔

(3)固定的或活的贴壁培养细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上;

(4)悬浮细胞,甩片或滴片后,用盖玻片封片;

(5)载玻片厚度应在0.8 - 1.2 mm之间,盖玻片应光洁,厚度在0.17 mm左右;

(6)标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部不能充分激发﹔

(7)尽量去除非特异性荧光信号;

( 8)封片剂多用甘油:PBS混合液(比例为9∶1 )。








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